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制藥工業中的生物催化

作者:N/A    | 發布時間:2015-06-06

由于具有反應條件溫和、催化效率高和專一性強的優點,利用生物催化或生物轉化等生物方法來生產藥物的組分已成為當今生物技術研究的熱點課題。繼醫藥和農業之后,工業生物催化已經被認為是“生物技術的第三次浪潮”,其核心則是生物催化劑的使用和生產。生物催化劑主要有兩種:全細胞和游離酶,兩者的實質都是酶,但前者酶保留在細胞中,后者酶則已從細胞中分離純化對于需要利用一種以上的酶和輔酶的復雜反應或酶不能游離使用的反應,通常采用全細胞的生物轉化,否則為了簡單起見則選擇游離酶。據推測,自然界中約有25000種酶,其中已被認可的有300多種。根據酶催化的反應類型,可將酶分為六類:氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶和聯結酶。

在生產小分子的藥物及中間體時,生物轉化和傳統的化學方法最顯著的區別就是非常有效地不對稱合成手性化合物。手性是生物體的基本特征,手性藥物是指有藥理活性的光學純化合物,體內許多內源性化合物,包括與藥物發生作用的天然大分子都具有手性。人體的手性環境可以識別手性藥物對映體,使對映體的藥代動力學和藥理學出現差異,不同手性的藥物作用于生物體時,它們所起的作用是不同的,在活性、代謝過程及毒性等方面存在顯著差異。正是基于這一原因,開發單一對映體形式的合成藥成為近幾年的研究熱點。

根據Technology Catalysts International(TCI)的統計,2000年,手性藥物的銷售額增加了13%,達到133億美元,而且TCI預測,到2008年,這一數值有可能達到200億美元,2000年,在市場上銷售的所有藥物中,有40%為單一對映體,而在1999年,僅三分之一為單一對映體[1]。生物催化劑還能合成經典的化學方法難以合成的非手性小分子化合物,此外酶還可用于生產大分子的化合物,如抗生素和有治療作用的蛋白質。

1 生物催化劑的應用

目前異構酶和聯結酶在這一領域的應用還較少,因此本文主要對氧化還原酶、轉移酶、水解酶和裂解酶在制藥工業中的應用狀況進行綜述。

1.1 氧化還原酶

氧化還原酶是一類催化物質進行氧化還原反應的酶類,被氧化的底物就是氫或電子供體,這類酶都需要輔助因子參與。據估計所有的生物轉化過程涉及的生物催化劑有25%為氧化還原酶。根據受氫體的物質種類可將其分為4類:脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶和加氧酶。

1.1.1 脫氫酶

脫氫酶的受氫體絕大部分是尼克酰胺二核苷酸(磷酸),作為輔助因子的尼克酰胺核苷酸有兩種:NAD+和NADP-。氧化還原反應在尼克酰胺環上進行,氧化狀態時環上N為4價,寫成NAD(P)+,還原后則寫成NAD(P)H。脫氫酶是以輔酶或輔基為受氫體,所以又稱為不需氧脫氫酶。Bommmarius等[2]利用亮氨酸脫氫酶,以不同的酮酸為底物合成了一系列手性氨基酸(見圖1)。在這一方法中,輔助因子通過甲酸脫氫酶再生。


圖1 脫氫酶催化酮酸化為手性氨基酸
Omapatrilat是血管緊張素轉化酶和肽鏈內切酶的抑制劑,臨床上可用于治療高血壓。L-6-羥基己氨酸是用于合成Omapatrilat的手性中間體,分別以氨基酸氧化酶和谷氨酸脫氫酶為催化劑,通過兩步反應可將外消旋-6-羥基己氨酸轉化為L-6-羥基己氨酸,轉化率為97%,對應體過量(e,e值),大于98%(見圖2)[3]。

1.1.2 氧化酶

氧化酶以氧分子為受氫體,所以又稱為需氧脫氫酶。這類酶常需要黃素核苷酸(FMH或FAD)為輔酶,且結合緊密,故又稱黃素蛋白。



圖2 酶法合成L-6-羥基己氨酸

 

氨基酸氧化酶催化氨基酸轉化為相應的酮酸,逆反應則由脫氫酶催化,例如以頭孢菌素C為原料,二步酶法制備7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)(見圖3)[4]。

阿昔洛韋是一種無環的鳥苷結構類似物,主要用于抑制單純皰疹病毒I、II型及E-B病毒作用。黃嘌呤氧化酶能催化各種含氮雜環化合物的區域選擇氧化。利用這一性質,能有效地將6-脫氧阿普洛韋氧化成阿昔洛韋(見圖4)[5]。



圖3 酶法制備7-氨基頭孢烷酸



圖4 酶法制備阿昔洛韋

1.1.3 過氧化物酶

過氧化物酶常以黃素FAD、血紅素為輔基擔負H2O2與過氧化物的分解與轉化,催化以H2O2為氧化劑的氧化還原反應。佳息患是HIV-I蛋白酶抑制劑,臨床上用于愛滋病的治療。生產佳息患的一個關鍵中間體反-1S,2R-氨基茚醇能以手性的1S,2R-環氧茚為前體合成,而以Curvularia protuberate MF5400中的溴過氧化物酶和脫氫酶為催化劑,可直接將茚轉化為1S,2R-環氧茚(見圖5)[6]。

圖5 酶法合成1S,2R-環氧茚

 

1.1.4 加氧酶

這類酶常伴隨羥基形成,故又稱為羥化酶。和氧化酶不同,它催化氧原子直接參入有機分子,可根據反應體系中氫供體數目分為兩個亞類:單加氧酶和雙加氧酶。

例如,在降血糖藥物格列吡嗪(glipizide)的合成中,其中一個前體就是在生物催化劑的催化下,直接將甲基基團上的一個非活化碳直接氧化而成(見圖6)[7]。


圖6 酶法合成格列吡嗪的前體

 


內酯化合物是重要的手性構架。Stewart[8]等將Acinetobacter sp NCIB9871中的環己酮單加氧酶在面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中進行表達,并以該酵母全細胞為催化劑催化不對稱的拜爾-維利格氧化反應,合成了一系列的內酯化合物(見圖7)。


圖7 環己酮單加氧酶催化的不同對稱的拜爾-維利格氧化反應

1.2 轉移酶

轉移酶能催化一種底物分子上的特定基團(例如酰基、糖基、氨基、磷酰基、甲基、醛基和羰基等)轉移到另一種底物分子上,在很多場合,供體是一種輔助因子(輔酶),它是被轉移基團的攜帶者,所以大部分轉移酶需有輔酶的參與。在轉移酶中,轉氨酶是應用較多的一類酶。這類酶通常都需要磷酸砒哆醛為輔酶。磷酸砒哆醛是維生素B6的衍生物,它除了參與轉氨基反應以外,也是脫羧反應以及消旋反應的輔酶。反應過程中先要形成活潑的西夫堿,然后再根據酶的催化特性進行相應的反應。轉氨酶的特點是底物特異性低,反應速度快,已被用于大規模合成非天然氨基酸,以滿足生產手性藥物的需要[9]。L-同型苯丙氨酸是抗高血壓藥依那普利(enalapril)的組分。D-苯丙氨酸和L-叔丁亮氨酸分別是抗血栓藥和抗愛滋病藥的組分。

L-絲氨酸是一個重要的藥用氨基酸。孫進等[10]利用絲氨酸羥甲基轉移酶催化甲醛和甘氨酸,可逆地合成L-絲氨酸(見圖8),反應過程中絲氨酸羥甲基轉移酶需要PLP和四氫葉酸作為輔助因子。最終反應液中L-絲氨酸濃度達到0.2 mmol/L,該法是目前最有應用前景的L-絲氨酸生產方法。



圖8 酶法合成L-絲氨酸

1.3 水解酶

水解酶是指在有水參加下,把大分子物質底物水解為小分子物質的酶,大多不可逆,一般不需要輔助因子。此類酶發現和應用數量日增,是目前應用最廣的一種酶,據估計,生物轉化利用的酶約三分之二為水解酶。在水解酶中,使用最多的是脂肪酶,其它還包括酯酶、蛋白酶、酰胺酶、腈水解酶、磷脂酶和環氧化物水解酶。由于脂肪酶較易獲得,在已報道的生物轉化過程約有30%與脂肪酶有關。常用的脂肪酶包括豬胰脂肪酶、假絲酵母屬脂肪酶、假單孢桿菌屬脂肪酶和毛霉屬脂肪酶。例如用固定化脂肪酶合成抗高血壓病藥物地爾硫卓(diltiazem)的一個關鍵中間體(見圖9)[11]。在這一過程中,目的產物的產率為40%~43%,光學純度(e,e值)為100%。


圖9 脂肪催化合成地爾硫卓的中間體


?酶法拆分也已廣泛應用于制藥工業。例如抗癌藥物泰素(taxol,人工半合成紫杉醇)的β-氨基酯側鏈就是用脂肪酶催化拆分外消旋氮雜環丁酮衍生物合成的(見圖10)[12]。


圖10 酶法制備泰素的β-氨基酯側鏈

酰胺酶通常含有Zn2+,它們催化L-氨基酸酰胺的水解。例如用惡臭假單孢菌中的酰胺酶可以合成癲癇病附加治療藥哌啶酸的衍生物(見圖11)[13]。

圖11 酶法合成哌啶酸的衍生物

該拆分工藝的生產規模已達到噸以上(e,e值大于99%),而且副產物可通過動態拆分循環利用。另一個使用較廣的酰胺酶是乙內酰胺酶,該酶常用于大規模制備D-氨基酸。例如用乙內酰胺酶工業化生產阿莫西林的側鏈D-對羥基苯甘氨酸(見圖12)[14],在該工藝中,非目的對映體可通過動態拆分循環利用。


 

圖12 兩步酶法合成D-對羥基苯甘氨酸

用磷酸化酶作為催化劑可制備天然和非天然的核苷。例如,用兩步酶法合成抗病毒藥利巴韋林(見圖13)[15]。

圖13 酶法合成抗病毒藥利巴韋林

 

D-泛酸鈣為維生素類藥物,用D-泛解酸內酯水解酶將DL-泛解酸內酯拆分得到D-泛解酸內酯,再與β-丙氨酸鈣縮合生產D-泛酸鈣。該方法工藝簡單,成本低,從環境角度考慮也有利[16]。

R-3-羥基4-腈丁酸乙酯是生產降膽固醇藥阿妥伐他汀(Atorvastatin,商品名Lipitor)的中間體。在已報道的用2,3-二羥基氯丙烷合成該中間體的方法,需要6步反應,而用腈水解酶催化表氯醇合成該中間體只需3步反應(見圖14)[17]。



圖14 腈水解酶催化表氯醇合成R-3-羥基-4-腈丁酸乙酯

 

1.4 裂解酶

裂解酶催化小分子在不飽和鍵(C-C,C-N和C-O)上的加成或消除、裂解酶中的醛縮酶、轉羥乙醛酶和氧腈酶3類酶在形成C—C時具有高度的立體選擇性,因而日漸引起關注。用醛縮酶催化的醛縮反應可用于將醛的長度延長2個或3個碳單元。類似于化學醛縮反應,該反應可能是將一個穩定的帶負電的碳加到醛上,并具有高度立體選擇性。


例如用固定化醛縮酶合成N-乙酰神經氨酸已達到噸以上的規模(見圖15)[18]。N-乙酰神經氨酸為神經氨酸苷酶抑制劑的前體,該抑制劑臨床上用于治療病毒性流感。

 


圖15 酶法合成N-乙酰神經氨酸

多巴胺是哺乳動物中樞神經系統的神經傳遞質,也是激素降腎上腺素和腎上腺素的前體。臨床上用于治療急性循環系統不全和低血壓。以3,4-二羥基-L-苯丙氨酸(L-DOPA)為底物,L-DOPA脫羧酶為催化劑可合成多巴胺(見圖16)[19]。


 

圖16 酶法合成多巴胺

在偶姻反應中成功的例子就是工業上用裂解酶制備L-麻黃素的前體(見圖17)[20],此反應所用的酶為丙酮酸脫羧酶,該酶需用焦磷酸硫胺素(TPP)作為輔助因子。

 

圖17 酶法合成L-麻黃素的前體

2 制藥工業中生物催化劑的生產

由于酶制劑的生產需要篩選菌種,培育高產菌株,同時由于酶的保存和使用的環境有比較嚴格的要求,所以應用在大規模工業化上的酶并不是多見。其中目前大規模應用在制藥行業中的有青霉素酰化酶、D-氨基酸氧化酶等。這些酶的固定化技術已經很成熟,我國在青霉素酰化酶的生產技術上已經跟西方國家大公司的相差無幾,我國自行研發的來自枯草桿菌和巨大芽孢桿菌以及大腸桿菌的青霉素酰化酶早就在工業化大規模生產中使用,價格也被國內制藥公司所接受。

在對映體選擇性合成和官能團區域性選擇轉化過程中,酶是非常有用的工具。在有機合成中,生物轉化適用的范圍也較廣。近年酶工程領域不斷涌現許多新的技術,如抗體酶、人工合成酶、模擬酶、交聯酶晶體等都是當今酶學研究領域的熱點。此外利用基因工程技術、蛋白質工程技術改善原有酶的各種性能;運用基因工程技術將原來有害的、未經批準的微生物產生的酶的基因,或由生長緩慢的、動植物產生的酶的基因,克隆到安全的、生長迅速的、產量較高的微生物體內,改由微生物來生產。隨著這些技術的發展與完善,未來必將會有更多的生物催化過程被應用于制藥工業[21]。

收稿日期:2003-2-18

參考文獻

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